蛋白類藥物如單克隆抗體和抗體偶聯(lián)藥物因具有極佳的治療效果與靶向作用正以火箭般的速度飛速發(fā)展，但這些藥物為患者帶來(lái)健康的同時(shí)，也為藥品研發(fā)人員帶來(lái)更大的壓力。因其在諸多環(huán)境暴露下的不穩(wěn)定性，需要制藥科學(xué)家們對(duì)藥物質(zhì)量進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控，以滿足生產(chǎn)和臨床需要。蛋白質(zhì)在制備，生產(chǎn)和運(yùn)輸存儲(chǔ)過(guò)程中可能面對(duì)著如凍融，高溫和震蕩的多重壓力，隨之而來(lái)的是對(duì)蛋白聚集體增多的擔(dān)憂。蛋白聚集會(huì)影響藥物安全，嚴(yán)重的蛋白聚集還可能增加對(duì)患者的免疫源性風(fēng)險(xiǎn)。令人欣慰的是，分子排阻色譜法作為監(jiān)控蛋白類藥物聚集體的有效檢測(cè)手段已經(jīng)成為一項(xiàng)金標(biāo)準(zhǔn)。我們使用ZF-LC-0001分子排阻色譜（SEC-HPLC）通用流動(dòng)相對(duì)單克隆抗體與抗體偶聯(lián)藥物進(jìn)行分析,獲得了令人非常滿意的效果。

目前SEC-HPLC方法已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，研究人員可以根據(jù)蛋白分子量選擇標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)化色譜柱進(jìn)行定量分析，但流動(dòng)相的選擇通常依賴經(jīng)驗(yàn)。這些流動(dòng)相一般為含鹽的水溶液，調(diào)配到一定的pH值后再進(jìn)行分析。然而含鹽流動(dòng)相在SEC-HPLC分析過(guò)程中會(huì)面臨容易長(zhǎng)菌的問(wèn)題，雖然在流動(dòng)相中加入0.5-1M氯化鈉會(huì)產(chǎn)生一定的抑菌效果，但效果有限且可能帶來(lái)鹽析堵塞儀器的風(fēng)險(xiǎn)。部分研究人員還會(huì)選擇在流動(dòng)相中加入少許疊氮化鈉來(lái)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但隨著化學(xué)品監(jiān)管逐漸嚴(yán)格，這項(xiàng)手段也成為不可能。在蛋白藥物研發(fā)階段，如預(yù)制劑處方開(kāi)發(fā)階段，往往需要進(jìn)行多處方篩選設(shè)計(jì)與全面的應(yīng)力實(shí)驗(yàn)，這些應(yīng)力實(shí)驗(yàn)包括高溫、凍融、光照與振蕩，實(shí)驗(yàn)的全面設(shè)計(jì)會(huì)帶來(lái)分析量的增加，如一次頭碰頭SEC-HPLC分析會(huì)大于200個(gè)樣本（N=3），這使得液相分析的時(shí)間大于4天。通常，一個(gè)序列的分析中間不可以中斷，若意外中斷會(huì)帶來(lái)新的校準(zhǔn)和系統(tǒng)平衡，且中斷前的數(shù)據(jù)仍需要進(jìn)行質(zhì)量保證評(píng)估才可以使用。為了解決這一問(wèn)題，舟帆生物新推出了一款SEC-HPLC通用流動(dòng)相（貨號(hào)：ZF-LC-0001），可以滿足樣品的持續(xù)分析，常規(guī)條件下十天之內(nèi)不會(huì)影響分析。

1. SEC流動(dòng)相抑菌效力對(duì)比

按照常規(guī)配方進(jìn)行配比制備本次實(shí)驗(yàn)所用不含舟帆生物特有配方流動(dòng)相。分別將對(duì)照組與 ZF-LC-0001流動(dòng)相（1×）罐裝至干凈透透明的1L流動(dòng)相瓶中，分別于0, 1, 2, 5, 10天時(shí)拍照留樣，記錄圖片如圖1所示。與對(duì)照組流動(dòng)相相比，ZF-LC-0001流動(dòng)相顯示出優(yōu)異的抗菌效力。結(jié)果顯示對(duì)照組流動(dòng)相于第1天即出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)異物，并于第2天現(xiàn)象加重，第5天取樣與第10天取樣拍照后發(fā)現(xiàn)兩者狀態(tài)相似。ZF-LC-0001流動(dòng)相直至第10天仍然保持清澈透明。此留樣階段的流動(dòng)相被用于后面實(shí)驗(yàn)的分析。

圖1. 常規(guī)流動(dòng)相與舟帆生物 ZF-LC-0001 流動(dòng)相抑菌效力對(duì)比

2. 日內(nèi)精密度與日間精密度分析

使用ZF-LC-0001在常規(guī)分析環(huán)境下放置10天后的流動(dòng)相，對(duì)重組抗人ER2抗體因子單克隆

抗體樣品進(jìn)行日內(nèi)精密度與日間精密的分析見(jiàn)圖2。數(shù)據(jù)表明流動(dòng)相在放置10天后仍然有非常好的日內(nèi)精密度與日間精密度：[保留時(shí)間（Time）與總峰面積(mAU)分別為圖A, C]，以區(qū)分序列間日內(nèi)的精密度。后3份于第2日進(jìn)樣一個(gè)輪次，與第1日第二輪次進(jìn)樣進(jìn)行日間精密度的對(duì)比（保留時(shí)間與總峰面積分別為圖B, D）。

圖2. 舟帆生物ZF-LC-0001流動(dòng)相日內(nèi)精密度和日間精密度

3. 數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高

使用ZF-LC-0001分析重組抗人ER2抗體因子單克隆抗體8個(gè)進(jìn)樣量梯度的過(guò)程，R2=0.9999，數(shù)據(jù)表明，在儀器最大分析限度內(nèi)，進(jìn)樣梯度的變化對(duì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性影響較小。

圖3. 舟帆生物ZF-LC-0001流動(dòng)相線性及進(jìn)樣量與總峰面積數(shù)據(jù)

4. 廣泛的樣品兼容性

使用ZF-LC-0001分析了5個(gè)單克隆抗體與2個(gè)抗體偶聯(lián)藥物的分子排阻色譜，我們將7個(gè)蛋白藥物全部使用純水稀釋至1mg/mL，統(tǒng)一進(jìn)樣，結(jié)果如圖4所示，表明了ZF-LC-0001流動(dòng)相無(wú)論在一般的單克隆抗體藥物或是疏水性較強(qiáng)的抗體偶聯(lián)藥物中均可以達(dá)到普適性分析的效果，并且對(duì)于低濃度進(jìn)樣，蛋白聚集體與單體仍然顯示出極好的分離度和分辨率。

圖4. 5種單克隆抗體與2種抗體偶聯(lián)藥物在低濃度下進(jìn)樣的SEC色譜圖

5. 改善分析圖譜

除此之外，與常規(guī)流動(dòng)相比，使用ZF-LC-0001能獲得更加完美的峰形，如圖5所示，峰寬更窄，拖尾得到改善，這樣可有效避免為減少拖尾向流動(dòng)相中加入有機(jī)溶劑，從而進(jìn)一步避免溶液鹽析堵塞分析系統(tǒng)，造成序列意外終止的風(fēng)險(xiǎn)。

圖5. 使用ZF-LC-0001與常規(guī)高鹽流動(dòng)相的SEC色譜圖對(duì)比（樣品分別為2種mAb與2種ADC藥物）

綜上所述，舟帆生物新推出的SEC-HPLC通用流動(dòng)相（貨號(hào)：ZF-LC-0001）具有以下突出優(yōu)勢(shì)：

• 卓越的抗菌能力，有效保護(hù)貴重儀器與高價(jià)值耗材不會(huì)在分析過(guò)程中受損；
• 優(yōu)異的穩(wěn)定性，在分析條件下放置10天后仍能達(dá)到令人滿意的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性與可觀的線性數(shù)據(jù)；
• 廣泛的樣品兼容性，適用于分析單抗、ADC、重組蛋白與多肽（此部分?jǐn)?shù)據(jù)未展示）等多種蛋白類藥物；
• 改善圖譜峰型，優(yōu)化拖尾問(wèn)題；
• 使用方便，對(duì)人體無(wú)毒害且環(huán)境友好。

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參考文獻(xiàn)：

Liu JZ, Li L, Fang WJ*. A novel size exclusion chromatography method for the analysis of monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates by using sodium iodide in the mobile phase. Pharm Res, 2024, in press.